試劑：CleanAmp™ PCR Kit

儀器：Mastercycler® ep realplex4 S qPCR instrument

分子診斷需求的不斷增長(zhǎng)（如新,冠,核,酸檢測(cè)），要求所用檢測(cè)試劑、設(shè)備能在更短的時(shí)間內(nèi)提供準(zhǔn)確的、可重復(fù)的檢測(cè)結(jié)果。這種需求下，多重實(shí)時(shí)PCR（Multiplex qPCR）是一項(xiàng)很有用的技術(shù)，可省時(shí)、省力、省樣本，還能降低成本。然而盡管多重qPCR檢測(cè)技術(shù)有著諸多優(yōu)點(diǎn)，但實(shí)際應(yīng)用時(shí)卻需要進(jìn)行很多的優(yōu)化來避免由于引物組增加而造成的擴(kuò)增效率下降的問題。Trilink的CleanAmp™ dNTP試劑完,美的解決了這一問題，本文展示了使用Trilink的CleanAmp™ dNTP試劑和靈敏的qPCR儀器實(shí)現(xiàn)快速三重qPCR的案例。

CleanAmp™ dNTP是Trilink運(yùn)用自己專業(yè)的核酸修飾技術(shù)開發(fā)的專,利產(chǎn)品。

PCR的熱啟動(dòng)，通常要通過使用熱啟動(dòng)酶來實(shí)現(xiàn)。而在PCR實(shí)驗(yàn)中，簡(jiǎn)單的將標(biāo)準(zhǔn)dNTP替換為CleanAmp™ dNTP，即可獲得與使用昂貴的熱啟動(dòng)酶相同的優(yōu)勢(shì)。CleanAmp™ dNTP是經(jīng)過修飾的核苷三磷酸，該修飾可以在反應(yīng)初期阻止核苷酸摻入直至dNTP被熱激活，如此可極大地減少錯(cuò)誤引發(fā)，避免引物二聚體形成以及其他可能的不良影響，從而在多重和快速PCR實(shí)驗(yàn)中具有非常好的性能。CleanAmp™ PCR Kit試劑盒中提供CleanAmp™ dNTP，并包括已成功驗(yàn)證過的DNA聚合酶。該試劑盒可以靈活地用于多種PCR檢測(cè)，包括快速和多重PCR。

Eppendorf realplex4 S real-time PCR系統(tǒng)使用超快的珀?duì)柼?/span>Peltier）熱循環(huán)模塊，可以以6°C /秒的速度加熱并以4°C /秒的速度冷卻，在一小時(shí)內(nèi)即可完成標(biāo)準(zhǔn)的40循環(huán)qPCR反應(yīng)。珀?duì)柼?/span>模塊還可以確保溫度控制的精確性以及較高的模塊均質(zhì)性，這對(duì)于高質(zhì)量PCR反應(yīng)至關(guān)重要。該系統(tǒng)的光學(xué)模塊是一個(gè)由96個(gè)LED 組成的陣列，這些LED可以預(yù)先選擇并均衡，以使它們可以均勻的激發(fā)所有樣本孔。這種設(shè)置消除使用其他常規(guī)qPCR儀器時(shí)，需要用ROX作為校正染料的必要性。Realplex4 S還使用了光電倍增管（PMT）進(jìn)行信號(hào)檢測(cè)，這是目前可用的最,靈敏，最,經(jīng)濟(jì)的檢測(cè)技術(shù)。

為了進(jìn)一步探索CleanAmp™ PCR試劑盒和Eppendorf realplex4 S real-time PCR系統(tǒng)的優(yōu)勢(shì)，本文的研究以這兩種技術(shù)的結(jié)合為特色，在30分鐘內(nèi)完成可重復(fù)性的實(shí)時(shí)三重PCR的檢測(cè)。

方法

使用CleanAmp™的dNTP試劑盒與水解探針在realplex4 S real-time PCR系統(tǒng)上進(jìn)行實(shí)時(shí)三重PCR檢測(cè)。使用CleanAmp™ PCR試劑盒擴(kuò)增了三個(gè)小鼠基因組DNA靶標(biāo)，分別為125、185和214個(gè)堿基對(duì)。實(shí)驗(yàn)分兩組進(jìn)行：首先，分別使用標(biāo)準(zhǔn)和快速PCR對(duì)三個(gè)靶標(biāo)同時(shí)進(jìn)行三重?cái)U(kuò)增（圖1）。其次，使用快速PCR對(duì)三個(gè)靶標(biāo)進(jìn)行同時(shí)擴(kuò)增和單個(gè)擴(kuò)增（圖2）。所有反應(yīng)均在帶有Master clear™蓋條的Eppendorf實(shí)時(shí)PCR管條中通過使用水解探針進(jìn)行檢測(cè)：125 bp（6-JOE; 0.2 µM），185 bp（FAM; 0.05 µM）和214 bp（ROX; 0.2 µM）。

首先，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)和快速循環(huán)流程下的三重qPCR實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了評(píng)估。所有反應(yīng)均設(shè)置一式四份，并使用小鼠基因組DNA的5倍系列稀釋液為樣本，范圍從320 pg至1.0 µg。標(biāo)準(zhǔn)熱循環(huán)qPCR實(shí)驗(yàn)的方案按照CleanAmp™ PCR試劑盒產(chǎn)品說明書中的“多重PCR方案" （1X PCR緩沖液（10 mM Tris-HCl（pH 8.3），50 mM KCl和2.5 mM MgCl2），0.4 mM CleanAmp™ dNTP，0.01 U / µL Taq DNA聚合酶和0.2 µM引物，25 µL）。在快速多重PCR實(shí)驗(yàn)方案在上述方案的基礎(chǔ)上進(jìn)行了以下改變：70 mM KCl，4.0 mM MgCl2，0.6 mM CleanAmp™ dNTP，0.33 U /μL U Taq DNA聚合酶，引物（125 bp和185 bp組為0.5 µM，214 bp引物組為0.7 µM）,15 µL)。

其次，在快速循環(huán)條件下進(jìn)一步評(píng)估CleanAmp™ dNTP試劑盒，分別以單重和多重反應(yīng)擴(kuò)增三個(gè)相同的靶標(biāo)。依然使用小鼠基因組DNA的5倍系列稀釋液為樣本，范圍從320 pg至200 ng，并設(shè)置三重復(fù)?？焖傺h(huán)條件和熱循環(huán)條件按照如上所述方案的進(jìn)行。對(duì)于單重反應(yīng)，遵循CleanAmp™ PCR Kit產(chǎn)品說明書中的“快速熱循環(huán)方案" （1x PCR緩沖液（10 mM Tris-HCl（pH 8.3），50 mM KCl和4.0 mM MgCl2），0.4 mM CleanAmp ™ dNTPs，0.33 U / µL Taq DNA聚合酶和0.5 µM引物，15 µL體系）。

結(jié)果與結(jié)論

對(duì)比標(biāo)準(zhǔn)和快速兩個(gè)條件下的三重 qPCR的結(jié)果顯示：兩者分別在1 h 26 min和24 min的熱循環(huán)時(shí)間內(nèi)得到穩(wěn)定的數(shù)據(jù)。在兩種反應(yīng)條件下，擴(kuò)增曲線間隔良好，重復(fù)緊密。R2值顯示標(biāo)準(zhǔn)曲線符合良好的線性，且不同靶標(biāo)、不同檢測(cè)的擴(kuò)增效率相當(dāng)(Figure.1)。同樣在快速循環(huán)條件下分別進(jìn)行的單指標(biāo)和三重指標(biāo)的擴(kuò)增結(jié)果也類似：對(duì)于每個(gè)靶濃度，單指標(biāo)和三重指標(biāo)的擴(kuò)增曲線重合，如圖2所示。因此，每個(gè)反應(yīng)相似的Cq值反應(yīng)了不同反應(yīng)的擴(kuò)增效率的一致性，如表(圖2B)所示。這些發(fā)現(xiàn)展示CleanAmp™ PCR試劑盒的多功能性和Mastercycler® ep realplex4 qPCR儀的速度，兩者相互補(bǔ)充，僅在24分鐘內(nèi)就能獲得高效、可重復(fù)的三重qPCR數(shù)據(jù)。

CleanAmp™ PCR試劑盒和Mastercycler® ep realplex4 S qPCR儀的組合使我們能夠在保持與標(biāo)準(zhǔn)PCR或單指標(biāo)PCR中可得到的高擴(kuò)增效率的同時(shí)，實(shí)現(xiàn)快速三重qPCR.

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