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中性粒細胞是血液中數(shù)量最多的白細胞，約占成人外周血白細胞的60-70%，小鼠中約為10-25%，是先天免疫的重要組成部分。中性粒細胞具有高度的異質(zhì)性和可塑性，在體內(nèi)發(fā)揮著多種看似矛盾的保護與致病作用，是一把“雙-刃劍"。一方面中性粒細胞是抗菌防御的重要效應細胞，通過吞噬、脫顆粒作用和形成胞外陷阱（NET）等方式消滅潛在病原體，另一方面它們在組織修復、纖維化相關(guān)的致病過程中發(fā)揮關(guān)鍵功能[1,2]。
中性粒細胞在腫瘤微環(huán)境中也扮演著復雜的角色，它們可以直接釋放活性氧、金屬蛋白酶等毒性物質(zhì)或調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)配體來消除腫瘤細胞，激活免疫系統(tǒng)間接抑制腫瘤進展，但同時自己也經(jīng)歷重編程，促進腫瘤免疫逃逸、血管生成和腫瘤生長[2-4]。中性粒細胞多樣而復雜的功能，使其成為近年免疫學研究的一大熱點，已經(jīng)有多項在研的癌癥免疫療法靶向中性粒細胞[2-4]。
圖1 截至2024年12月31日，在PubMed用 “neutrophil" 檢索到的文獻數(shù)量，2020年開始激增。
中性粒細胞存活時間短，更新速度快，增加了研究的技術(shù)難度。近年來單細胞分析技術(shù)的發(fā)展推動了對中性粒細胞異質(zhì)性的深入研究。而要在體內(nèi)證明是中性粒細胞起作用，一種廣泛使用的經(jīng)典方法是給實驗動物，比如小鼠注射Ly6G抗體，在體內(nèi)清除中性粒細胞，再進一步進行功能檢測，比如檢測清除中性粒細胞對腫瘤體積的影響。
小鼠Ly6G是一種糖基化的磷脂酰肌醇錨定的細胞表面蛋白，通常在單核細胞發(fā)育過程中瞬時表達，而在成熟粒細胞和外周血中性粒細胞持續(xù)表達。其1A8單克隆抗體特異性地與小鼠Ly6G反應，被廣泛用于體內(nèi)中性粒細胞清除[5]。
表1 小鼠Ly6G抗體1A8比Gr-1抗體RB6-8C5更特異地在體內(nèi)清除中性粒細胞，對循環(huán)淋巴細胞影響較小[5]。
Bio X Cell公司具有超過25年的單克隆抗體及重組蛋白的生產(chǎn)和定制經(jīng)驗，提供高純度、低內(nèi)毒素、無防腐劑的單克隆抗體，適用于各種臨床前功能實驗，尤其是動物體內(nèi)研究。
Bio X Cell提供的兩種小鼠Ly6G抗體克隆1A8產(chǎn)品，InVivoMAb anti-mouse Ly6G（#BE0075-1）和InVivoPlus anti-mouse Ly6G（#BP0075-1），據(jù)CiteAb網(wǎng)站數(shù)據(jù)，截至2024年底，已分別被296篇和88篇文獻引用，展現(xiàn)了良好的中性粒細胞體內(nèi)清除效果。兩者純度都大于95%，且經(jīng)過0.2μm過濾，消除內(nèi)毒素和疊氮化合物的影響。InVivoPlus系列內(nèi)毒素更低至1EU/mg以下（InVivoMAb為<2EU/mg），而且額外經(jīng)過生物學結(jié)合驗證、小鼠病原體檢測和單體率檢測。
這里選取三篇2024年的高分文獻，介紹Ly6G抗體在小鼠體內(nèi)清除中性粒細胞的具體應用和研究發(fā)現(xiàn)，以供參考。
CD49f高表達肝癌細胞亞群免疫逃逸機制[6]
來自上海交通大學醫(yī)學院附屬仁濟醫(yī)院-上海市腫瘤研究所覃文新研究員/王存研究員團隊和復旦大學附屬中山醫(yī)院高強教授團隊的Cancer Cell論文。
研究人員首先鑒定到CD49f是肝細胞癌中腫瘤起始細胞（TIC）的一個顯著的標志物，發(fā)現(xiàn)CD49f高表達TIC通過CXCL2-CXCR2軸特異性招募中性粒細胞形成免疫抑制微環(huán)境。
圖2 第一行從左至右，實驗流程示意，極限稀釋法檢測Hep53.4細胞致瘤潛能，以及CD49f+GFP+細胞的占比。第二行，流式細胞分析驗證C57BL/6小鼠外周血和腫瘤中的中性粒細胞清除效率（每組n=6只小鼠）。
中性粒細胞胞外陷阱形成的調(diào)控機制[7]
這項發(fā)表在Nature上的研究發(fā)現(xiàn)髓樣抑制性C型凝集素樣受體（MICL）是NET的重要模式識別受體，MICL識別NET后能夠抑制中性粒細胞活化和NET的進一步形成，高水平的MICL自身抗體可能與類風濕性關(guān)節(jié)炎（RA）、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等自身免疫性疾病進展相關(guān)。
研究人員用Micl-/-小鼠構(gòu)建了CAIA（collagen antibody-induced arthritis）的RA模型，Micl敲除小鼠出現(xiàn)了增強以及非緩解的關(guān)節(jié)炎表型，流式分析發(fā)現(xiàn)其關(guān)節(jié)組織中浸潤的中性粒細胞特異性增多而且高度活化。
圖3 上圖, CAIA模型中性粒細胞清除策略。左下圖, 流式細胞術(shù)定量檢測第9天外周血中的中性粒細胞（CD45+CD11b+F4/80-SSChigh），1次實驗每組3只小鼠。右下圖，小鼠的嚴重程度評分，1次實驗每組5只小鼠。
中性粒細胞來源遷移體在凝血中的關(guān)鍵作用[8]
來自清華大學生命科學學院俞立教授團隊。遷移體是俞立團隊發(fā)現(xiàn)并命名的遷移細胞的細胞器，近期這篇Nature Cell Biology論文報道了遷移體在凝血中的新功能。
作者發(fā)現(xiàn)人和小鼠血液中存在大量中性粒細胞來源的遷移體，這些遷移體表面吸附和富集凝血因子，還高度富集粘附分子，能夠迅速聚集到損傷部位激活血小板促進凝血反應。
圖4 第一行, 小鼠全血細胞流式分析，以及中性粒細胞來源遷移體成像流式分析驗證中性粒細胞清除。第二行，清除中性粒細胞或血小板之后小鼠尾尖出血量增加。第三行，注射中性粒細胞來源遷移體恢復中性粒細胞清除小鼠的凝血。
要確定具體實驗中合適的抗體劑量和給藥頻率，需要考慮多種因素，比如小鼠品系年齡體重、疾病模型、研究期限以及環(huán)境因素等等，克隆1A8清除中性粒細胞的單次給藥劑量通常在7.5mg/kg到20mg/kg之間，可以參閱Bio X Cell產(chǎn)品豐富的引用文獻并進行預實驗評估。
其次需要設置同型對照組消除背景，并進行流式細胞分析，檢測體內(nèi)的清除效率。Bio X Cell為兩個系列的Ly6G抗體分別提供同系列的同型對照，InVivoMAb rat IgG2a isotype control（#BE0089）和InVivoPlus rat IgG2a isotype control（#BP0089）。
另外，2024年Science Immunology上的一項研究基于甲流病毒誘導的肺損傷模型鑒定了一群表達Ly6G的非典型巨噬細胞，打破了在成熟細胞中Ly6G表達限于粒細胞的慣有認知[11]。
圖5 小鼠Ly6G抗體（#BE0075-1）1：1500稀釋在KrasLSL-G12D/+;Trp53fl/fl（KP）和KrasFSF-G12D/+;Trp53Frt/Frt;Rosa26FSF-CreERT2;Nkx2-1fl/fl（KPN）小鼠腫瘤FFPE切片中的IHC圖像和陽性細胞定量[12]。
圖6 小鼠Ly6G抗體（#BE0075-1）1：2000稀釋用于寄生蟲感染的小鼠肺組織冰凍切片IF實驗圖像[13]。
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參考文獻
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7. Malamud, M, et al (2024) Recognition and control of neutrophil extracellular trap formation by MICL. Nature. 633(8029):442-450. doi: 10.1038/s41586-024-07820-3.
8. Jiang, D, et al (2024) Neutrophil-derived migrasomes are an essential part of the coagulation system. Nat Cell Biol. 26(7):1110-1123. doi: 10.1038/s41556-024-01440-9.
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10. Hirschhorn, D, et al (2023) T cell immunotherapies engage neutrophils to eliminate tumor antigen escape variants. Cell. 186(7):1432-1447. doi: 10.1016/j.cell.2023.03.007.
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12. Mollaoglu, G, et al (2018) The lineage-defining transcription factors SOX2 and NKX2-1 determine lung cancer cell fate and shape the tumor immune microenvironment. Immunity. 49(4):764-779. doi: 10.1016/j.immuni.2018.09.020.
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